Menu

REGLAMENTO TÉCNICO PRUEBAS DE EFICACIA PARA REGISTRO DE ANTIPARASITARIOS INTERNOS PARA RUMIANTES Y PORCINOS

CAMEVET

Cod: AI 001

TRÁMITE VI

Septiembre de 2010

REGLAMENTO TÉCNICO 

PRUEBAS DE EFICACIA PARA REGISTRO DE ANTIPARASITARIOS INTERNOS PARA RUMIANTES Y PORCINOS

Consideraciones para la revisión de los documentos de trabajo

Metodología para unificar las modificaciones en los documentos

Es altamente recomendable el uso de la función de “control de cambios” instalada en el programa Microsoft Word. (Ubicada en la barra de tareas, menú “Herramientas”). Este modo de edición permite el modificar los documentos, indicando los cambios realizados.

En el caso de no utilizarse esta función, los criterios para identificar las modificaciones que se hagan en cualquier documento serían las siguientes:

- Texto agregado al documento: en color rojo, subrayado. Ejemplo: Texto agregado

- Texto eliminado del documento: en color rojo, tachado. Ejemplo: Texto eliminado

- Comentarios (que no se incluirán en el texto, pero se incluirán para mayor comprensión por parte del revisor): en color azul, en itálica. Ejemplo: Comentario al párrafo…

Identificación de los documentos

Con el fin de poder ordenar los documentos que se reciban en la Representación, se recomienda el cambio del nombre del documento, agregando la referencia a quién lo ha revisado. 

Por ejemplo, para un documento denominado “criterios aceptación.doc”, la revisión deberá ser renombrada como “criterios aceptación revisada colombia.doc”

Aparte del cambio en el nombre del documento, es conveniente la inclusión en el documento revisado del texto “Revisado por…”. (Aclarando los datos de la persona responsable de la revisión, así como la forma de contactarla, en el caso de ser necesario).

 REGLAMENTO TÉCNICO 

PRUEBAS DE EFICACIA PARA REGISTRO DE ANTIPARASITARIOS INTERNOS PARA RUMIANTES

1. PRUEBAS DE EFICACIA PARA ANTI-HELMÍNTICOS 

1.1. Prueba Controlada

1. La prueba controlada es el procedimiento más confiable para la determinación de la eficacia de anti-helmínticos en rumiantes. Las pruebas de eficacia se realizan con infestaciones inducidas artificialmente (para evaluar la eficacia sobre estadíos larvarios y adultos) o en animales con infestación natural (para la evaluación respecto a estadíos adultos), siempre con un mínimo de seis (6) animales por grupo (WAAVP). Las infestaciones naturales son preferibles, porque los animales contendrán, probablemente, la variedad y la cantidad de parásitos nativos característicos del área geográfica donde se realiza el ensayo. El desarrollo de pruebas con infestaciones inducidas artificialmente e infestaciones adquiridas naturalmente, permitirán, de un modo cierto, la evaluación simultanea de una amplia variedad de helmintos.

2. La distribución de los animales en grupos para estudios experimentales deberá hacerse utilizando métodos de asignación a los grupos que permitan desarrollar estudios estadísticos apropiados posteriormente. Se sugiere utilizar el método que se describe a continuación: 

3. Para asignar los animales a los grupos de trabajo, deberán ser listados en orden decreciente, de acuerdo al recuento de huevos por gramo de heces realizado entre los días -2 al día 0 previo al tratamiento. Los dos animales con el recuento más elevado serán destinados a la repetición número 1, los dos siguientes a la repetición número 2, hasta que se forme un mínimo de seis repeticiones.  Dentro de cada repetición, un animal deberá ser destinado al azar a cada uno de los grupos de tratamiento (control no tratado o tratado).

4. La eficacia será determinada por comparación entre la diferencia del número de helmintos recuperados durante la necropsia parasitológica en los grupos medicados y controles.

5. En el caso de las pruebas controladas para verificación de la eficacia anti-helmíntica contra determinadas especies de nematodos, los animales deberán ser sacrificados entre 4 y 7 días después del tratamiento. Este plazo puede ser aumentado de acuerdo con la farmacocinética del compuesto. 

1.2 Metodología de Necropsias

1.2.1 Intervalo entre el tratamiento y la necropsia:

1. Este intervalo depende de la farmacocinética y/o control prolongado del producto y estos factores deben estar correlacionados con el tratamiento al establecer el intervalo. Dado que el periodo de acción prolongada varía de acuerdo a la especie parasitaria, este periodo deberá ser determinado para cada especie si se desea establecer una indicación de uso específica en los rótulos del producto. Cuando la acción prolongada ha sido demostrada para un producto frente a especies parasitarias específicas, no debería existir la necesidad de determinar su actividad frente a cada estadío.   

2. Para productos orales, tópicos (intradérmicos) o parenterales que alcanzan sus niveles terapéuticos rápidamente y/o poseen poco o ninguna acción prolongada, la necropsia se deberá realizar 4 - 7 días luego del tratamiento frente a los nematodes adultos y en los límites superiores del periodo de prepatencia para los estadíos larvales y de adultos jóvenes. Cuando se ensayan productos de acción preventiva, se requieren intervalos más prolongados de entre semanas y meses entre el tratamiento y la necropsia.

1.2.2 Programación de las necropsias.

1. Cuando la necropsia de todos los animales no puede ser completada en 1 día, réplicas o un número igual de animales de cada grupo de tratamiento deberán ser examinados diariamente y tan rápidamente como sea factible, preferentemente en un total de 3 - 4 días. Las razones por un periodo de necropsia extendido  deberán ser documentadas.

1.2.3 Métodos

1. La identificación de cada animal debe ser verificada cuidadosamente y todos los órganos a ser examinados, etiquetados con números de identificación animal, caso contrario los resultados pueden ser comprometidos.

2. Los animales deberán ser sacrificados humanitariamente y proceder con la necropsia de inmediato. Todos los procedimientos, incluyendo la recolección de muestras del tracto gastrointestinal, deberán ser los mismos para todos los animales. Se colocarán doble ligaduras o grampas de sujeción en los extremos omasal y pilórico del abomaso, como también en la unión ileocecal. El abomaso, intestino delgado y grueso son separados y liberados de excesivas adherencias mesentéricas y tejido graso.

3. Se obtendrán dos muestras del 5% del contenido total abomasal e intestino delgado. Una de estas muestras servirá de soporte en el caso de un accidente. Cuando se esperan resultados bajos en los animales controles el tamaño de la muestra puede ser incrementado. Pueden ser recolectadas muestras más reducidas si las cargas parasitarias son adecuadas para lograr diferencias estadísticas. El volumen total y final de todas las muestras y el número y tamaño de las alícuotas recolectadas deberá ser registrado.

1.2.4 Contenido del abomaso

1. El abomaso se abre y su contenido es vertido en un balde calibrado mediante el  lavado minucioso bajo un chorro continuo de agua de canilla,. El volumen de contenido lavado se llevará a 2:1 y 4:1 para ovinos y bovinos, respectivamente. En algunos casos puede ser necesario una cantidad mayor de agua para lavar el abomaso correctamente. El volumen de agua usado debe ser registrado. Luego de un mezclado minucioso, se toman dos alícuotas del 5% del balde y se mezclan con suficiente cantidad de formol 10% u otro fijador para su examen posterior. De no emplear un fijador, las muestras se procesarán inmediatamente como se describe en esta sección (Recuperación de nematodes). 

1.2.5 Mucosa del abomaso.

1. La mucosa puede ser procesada por cualquiera de los métodos siguientes:

1.2.5.1 Método de incubación (Williams et al., 1979, 1981).

1. Se remojan los tejidos abomasales, con la superficie mucosal hacia abajo, en solución salina a 37º - 40º C durante 24 horas. Luego La superficie y pliegues del abomaso son lavados cuidadosamente en solución salina y el volumen obtenido del lavado se agrega al correspondiente remojado. El volumen del lavado puede ser pasado por un tamiz de 38 µm y el residuo examinado para determinar parásitos. Más frecuentemente este residuo es diluido en 2 a 4 litros de agua de canilla (registrar el volumen exacto).  La suspensión resultante debe mezclarse cuidadosamente y se toman dos alícuotas del 5% fijadas en formol para su examen posterior. En este procedimiento casi todas las larvas migrarán desde la mucosa al agua y se recuperan intactas con facilidad.

1.2.5.2 Método de digestión

1. La superficie de la mucosa es raspada, desprendiéndola del abomaso. La solución digestiva puede ser pepsina 1% en HCl 3% o simplemente HCl 3%. El volumen en peso, de esta solución deberá ser de por lo menos tres veces el peso de la mucosa. El material mucosal se digiere en la solución digestiva y en baño de María a 37º - 40ºC por no más de 4 – 6 horas. La concentración enzimática, temperatura, y duración de la digestión debe ser controlada dado que el exceso de temperatura y/o una digestión prolongada destruirá a los nematodes. Cuando es controlado cuidadosamente, este método recuperará aproximadamente 10% más larvas que el método anterior  de incubación. 

2. El producto de la digestión puede luego ser pasado por un tamiz de 38 µm y el residuo examinado para determinar parásitos. Más frecuentemente este residuo es diluido en 2 a 4 litros de agua de canilla (registrar el volumen exacto).  La suspensión resultante debe mezclarse cuidadosamente y se toman dos alícuotas del 5% fijadas en formol para su examen posterior. El método digestivo es lento de manera que antes de comenzar, el raspado del abomaso de varios animales controles se estudiarán bajo lupa estereoscópica para asegurar la presencia de larvas.

1.2.6 Intestino delgado

1. El intestino delgado deberá ser abierto en su largo total y su contenido vertido en un recipiente grande. El intestino abierto se enjuagará dos veces y luego pasado por los dedos prensados dejando caer el contenido en el mismo recipiente. El contenido se llevará a 2 – 4 litros, dependiendo del tamaño del animal, será mezclado cuidadosamente y se tomarán dos alícuotas del 5% formalizadas. El método de la digestión no puede ser usado para recuperar parásitos del intestino delgado salvo para los estadíos larvales de Chabertia y Oesophagostomum.

1.2.7 Intestino grueso

1. El contenido del intestino grueso es recolectado y procesado de igual manera que el intestino delgado. Sin embargo, parásitos adultos grandes deberán ser desprendidos de la superficie mucosal y el contenido lavado sobre un tamiz grande (150 µm para estadíos adultos, 50 µm para estadíos inmaduros) antes que los parásitos sean recuperados y contados. La digestión de la mucosa es innecesaria salvo para recuperar larvas de Chabertia y Oesophagostomum.  

1.2.8 Métodos de Laboratorio

1.2.8.1 Recuperación de nematodes.

1. Las muestras del abomaso o intestino delgado deberá pasarse por un tamiz de 38 µm y el residuo transferido a frascos de boca ancha. Las muestras que no tienen fijador y parásitos vivos deberán ser lavados con agua tibia para evitar el amontonamiento y anudado de los ejemplares, en especial de Nematodirus spp. El uso de un fijador para matar a los parásitos previo a pasar la muestra por el tamiz evita que los nematodes se amontonen , se anuden,  y enrosquen en la superficie del tamiz o repten a través de los orificios de la malla.

1.2.8.2 Conteo e identificación de los parásitos.

1. La muestras deberán ser codificadas de manera que el (los) operador (es) ignoren el grupo del tratamiento. Los parásitos en un alícuota del 5% del contenido abomasal e intestinal y del raspado de mucosa del abomaso, deben ser contados. En los casos que el número de parásitos sea elevado, se puede recurrir a subalícuotas, pero se usarán subalícuotas de igual tamaño en todos los animales. Los métodos de conteo deberán ser iguales para todas las muestras. Los números, especies y estadíos de los nematodes de cada alícuota y de cada animal deberá ser registrado. Pueden agregarse unas pocas gotas de una solución de yodo al 45% a la muestra para teñir a los parásitos y el fondo ser limpiado con una solución de tiosulfato de sodio al 5% de manera de poder ver los parásitos teñidos con mayor claridad. Tomar 100 larvas y 100 ejemplares machos, o la cantidad que sea factible hasta ese número, y transferir a portaobjetos para su examen detallado. Una gota o dos de lactofenol puede agregarse para desteñir los ejemplares adultos y facilitar su identificación. (Se sugiere consultar los métodos de conteo de Clark et al (1971), Reinecke (1973) y Clark y Turton (1973)).

2. El número total de Bunostomum, Trichuris, Oesophagostomum y Chabertia son contados mejor mediante el examen directo de la mucosa y del contenido total intestinal.

1.2.9 Pruebas con parásitos del pulmón

1. Los ensayos para determinar la titulación de la dosis y confirmar ésta frente a Dictyocaulus viviparus y Dicyiocaulus filaria pueden ser realizadas en forma conjunta con los de los parásios Gastrointestinales. Los ensayos frente a Protostrongylus rufescens, Muellerius, Cystocaulus y Neostrongylus spp se  realizan frentre a infecciones naturales. Se identifican los animales que albergan parásitos pulmonares mediante las técnicas de  recuperación larvaria de Baermann.

2. Para  las infecciones experimentales de Dictyocaulus spp., deben usarse 1500 – 3000 ó 25 L3  kg –1 peso vivo. Pueden administrarse en un inóculo tanto  mono- como multi-específico conjuntamente con nematodes gastrointestinales. En ganado vacuno, el tercer y cuarto estadío de D.viviparus ocurren a los 3 días y 5 – 6 días luego de la infección experimental, respectivamente, y el periodo máximo de prepatencia es de 21 – 24 días. En ovinos y caprinos, el tercer y cuarto estadío se cumplen a los 2 días y 6 – 8 días, respectivamente, y el periodo máximo de prepatencia es de 28 – 30 días. Dictyocaulus spp puede ser administrado conjuntamente con nematodes gastrointestinales en el inóculo de “goteo” para determinar la eficacia del producto frente a L3 y L4. En este método los terneros deberán ser infectados diariamente con 500 D.viviparus L3  entre los días –6 a –1, y en ovinos, con 200 D.viviparus L3 por día entre los días –8 a –1. Las infecciones con D.viviparus no pueden ser establecidas conjuntamente con G.pachyscalis en razón de la inmunidad cruzada (Horak, 1971).

1.2.9.1 Programa de tratamiento y necropsia

1. Las necropsias se realizarán 4 – 7 días post-tratamiento para la infección con adultos y 24 días (post-prepatencia) para las larvales. 

1.2.9.2 Métodos de necropsia

1. Para Dictyocaulus y Protostrongylus en el lumen bronquial, se corta la traquea y bronquios de los lóbulos diafragmáticos hasta las ramas finas terminales del árbol bronquial. Los nematodes pulmonares se recolectan y cuentan o son fijados en formol 10% para examen posterior. Los pulmones son cortados en cubos de 2 cm x 2cm y colocados en un recipiente con solución salina durante 1 – 2 h o a 40ºC durante 3 – 4 h a temperatura ambiente (25ºC). Se deberá tener cuidado para sumergir el tejido pulmonar flotante en la solución salina. Luego de la remoción de los cubos, el líquido de lavado es tamizado y los parásitos contados. Es innecesario el examen de las muestras homogéneas de tejido pulmonar dado que contienen menos del 1% de la carga parasitaria. Los parásitos deben ser conservados en formol 10% en el caso de no poder ser contados de inmediato.

2. El método de la perfusión es una alternativa válida. Se hace circular agua de canilla por el pulmón por medio de una cánula introducida en la arteria pulmonar.  Todos los estadíos parasitarios son expulsados por la tráquea, juntados y contados. El método es especialmente útil para recuperar los estadíos inmaduros de Dictyocaulus spp. 

3. En el caso de Muellerius y Cystocaulus que son difíciles de separar de los nódulos, abordar un nódulo en profundidad y extraer una gota de líquido bronquiual mediante una moderada presión. Colocar parte de este líquido extraído en un portaobjeto, agregar unas pocas gotas de solución salina, mezclar, colocar un cubreobjeto y examinar al microscopio para huevos y larvas, indicativos de adultos viables en el parénquima pulmonar. Los ejemplares adultos pueden ser contados mediante el corte en pequeños trozos del total de tejido de los nódulos y la búsqueda de los parásitos bajo una lupa estereoscópica. Los parásitos adultos pueden estar encerrados en el pulmón en pequeños “nudos parasitarios”, de localización mayoritariamente subpleural. Estos parásitos son inactivos sexualmente y no deberán ser usados en la evaluación del potencial antiparasitario pulmonar de un producto.

1.2.9.3 Criterio de eficacia

1. Para la titulación y confirmación de dosis de Dictyocaulus spp., la eficacia es determinada mediante diferencias estadísticas significativamente diferentes en las cargas parasitarias entre animales tratados y controles. En los ensayos clínicos, la eficacia es medida por las diferencias en los conteos de L1 realizados en 3 días consecutivos, comenzando desde los 4 – 7 días post-tratamiento. 

2. Con Muellerius y Cystocaulus, la evaluación es difícil por cuanto lo conteos totales de parásitos son imposibles de realizar. Es factible comparar las medias de L1 por gramo de materia fecal pre- y post-tratamiento. Sin embargo, las L1 generalmente son menos susceptibles al tratamiento antiparasitario que los adultos, haciendo frecuentemente necesario dos tratamientos con una semana de intervalo,  para alcanzar el control adecuado. Es posible que continúe la eliminación de larvas y la eficacia puede ser evaluada durante 3 semanas siguientes al segundo tratamiento. Los conteos de larvas deben ser repetidos por lo menos tres veces en el término de una semana. A veces el tratamiento trae aparejada una reducción transitoria de producción de huevos y esta posibilidad puede ser determinada mediante el examen de materia fecal 2- 4 semanas después del mismo.  

1.3 Cálculo de Eficacia y Análisis Estadístico

1. Los test de hipótesis de eficacia se efectuarán para un nivel de confianza del 95% (<0.05), redondeando los números en los resultados logrados en todos los cálculos matemáticos. Con la cantidad de parásitos de cada especie de nematode hallada se calcula la media geométrica (MG) de cada especie parasitaria.

2. El porcentaje de reducción (eficacia) de la cantidad de nematodes (PR) se calcula a través de la siguiente fórmula (Power et al, 1982):

PR = [(MG) Controles – (MG) Tratados) ./. (MG)Controles] x 100.  

MGC = media geométrica en el grupo control

MGT = media geométrica en el grupo tratado

3. Esta fórmula fue desarrollada originalmente utilizando la media aritmética. No obstante, para rumiantes, en la mayor parte de los casos y con un mínimo de seis animales por grupo, se indica el uso de la razón geométrica, en lugar de la media aritmética. Esto dependerá, sobretodo, de que los recuentos de vermes tengan o no una distribución normal. En general, con el uso de la media aritmética se precisa mayor cantidad de animales que la geométrica.

4. En un test de eficacia de un antiparasitario interno, el análisis estadístico de datos que no poseen una distribución normal (ejemplo: número de parásitos, valores de pH) determinado por el procedimiento univariado de SAS (Staystical Analysis System), los datos se compararán a través del test de Kruskal-Wallis (aproximación Chi2). La comparación de las diferencias entre los grupos se llevará a cabo usando el test de comparaciones múltiples no paramétrico de Dunn (Hollander & Wolfe, 1973) o similar (WAAVP).

1.4.- Evaluación de la Prueba controlada

1. La eficacia será evaluada de acuerdo al siguiente criterio:

Altamente efectivo > 98%

Efectivo 90-98%

Ayuda en el control 80-89% (ayuda en el control)

Insuficientemente activo < 80% (no registrable)

Ayuda en el control sólo se acepta para antiparasitarios efectivos para una categoría  y que son marginalmente eficaces para otra (caso ivermectina inyectable en mosca de los cuernos)

1.5.- Prueba controlada con animales naturalmente infestados

1. Los animales (preferentemente menores de un año de edad, similar peso, sexo, raza e historia previa de contaminación y tratamientos) a ser empleados en la prueba serán mantenidos a pastoreo, en potreros cerrados, naturalmente infestados con una carga alta y mixta de larvas de especies de parásitos internos de rumiantes, en la búsqueda de que se produzca la contaminación natural de los mismos (se dará preferencia a un potrero que contuviera anteriormente a animales jóvenes sin tratamiento). Previo a su ingreso los animales recibirán un tratamiento antihelmíntico con una droga de distinto grupo que el del ensayo y sin acción prolongada, y un examen coprológico para constatar la ausencia de huevos. 

2. Después de un período mínimo de 21 días de pastoreo, los animales del ensayo serán examinados individualmente por medio de exámenes de heces (hpg) y de coprocultivos para determinar el grado de parasitación y los géneros de nematodos presentes. De acuerdo a los resultados obtenidos, los animales serán distribuidos en dos grupos de forma homogénea, según peso vivo y carga parasitaria:

GRUPO I - Control, sin tratamiento, con un mínimo de 6 animales;

GRUPO II - tratado, siguiendo la dosis y la vía de administración recomendada por el laboratorio fabricante, con un mínimo de 6 animales.

3. Pueden incluirse otros grupos si el laboratorio presenta en el protocolo más de una vía de administración del producto. El Grupo I control es válido para todos.

4. Se recomienda que las medias de los recuentos individuales del número de huevos de helmintos por gramo de heces (hpg) de los grupos sea, como mínimo, de 500 huevos para ovinos y 300 huevos para bovinos. Siete días antes del tratamiento, los animales de los grupos I y II serán transferidos a instalaciones con piso de concreto donde recibirán alimentación y agua ad libitum. En el día cero, día del tratamiento, y luego cada 2 días de intervalo hasta el sacrificio de los animales (en los tiempos recomendados en el punto 1.1, párrafo 5), se recogerán muestras fecales para realizar exámenes de heces, mediante los cuales se determinará el número de huevos por gramo de heces (hpg), la presencia de larvas de Dictyocaulus spp. y coprocultivos para la identificación de los géneros de nematodos presentes. La eficacia del tratamiento será determinada conforme a la ecuación descrita en el Item 1.1. En el caso de observarse una carga parasitaria muy baja en el grupo control, el ensayo podrá ser invalidado.

5. Las infestaciones inducidas artificialmente pueden ser superpuestas a la infestación natural para garantizar una mejor carga parasitaria. Tienen además la ventaja de poder incluir nematodes de especies menos comunes y garantizar la buena presencia de las formas inmaduras.

1.6.- Prueba controlada con animales infestados artificialmente

1. Para pruebas con infestación artificial, deberá utilizarse la siguiente tabla para establecer la dosis mínima de larvas infectantes por especie:

Tabla 1: Número de larvas viables de tercero estadío utilizadas para producir infecciones en bovinos, ovinos e caprinos, con fines de evaluación de agentes anti-helmínticos.

Bovinos

Haemonchus placei 5000-10000

Ostertagia ostertagi 10000-20000

Trichostrongylus axei 10000-15000

Cooperia oncophora 10000-15000

Cooperia pectinata 10000-15000

Cooperia punctata 10000-15000

Nematodirus spathiger 3000-6000

Nematodirus helvetianus 3000-6000

   

Bunostomum phlebotomum 1000

Oesophagostomun radiatum / O. venulosum 1000-2500

Chabertia ovina 1000

Strongyloides papillosus 200000

   

Ovinos/Caprinos  

Haemonchus contortus 2500-4000

Teladorsagia circumcincta 5000-10000

Trichostrongylus axei 3000-6000

Trichostrongylus colubriformis + T. vitrinas 3000-6000

Cooperia curticei 3000-6000

Nematodirus spp. 3000-6000

Oesophagostomum columbianum 800

Oesophagostomum venulosum 1000

Bunostomum trigonocephalum (subcutaneo) 1000

Strongyloides papillosus (subcutaneo) 80000

Chabertia ovina 800

Gaigeria pachyscelis (cutaneo) 400

1.6.1.- Tiempo de tratamiento para determinar la eficacia contra varios estadíos de parásitos en infecciones inducidas artificialmente

1.6.1.1.- Adultos

1. Para la evaluación de la eficacia de drogas contra nematodos adultos en infecciones artificialmente inducidas, el tratamiento no debe ser efectuado antes de 21 a 28 días después de la infección, excepto para Strongyloides, Oesophagostomum spp y Bunostomum spp. El intervalo de tiempo para estos géneros debe ser 14-16, 35-41 y 52-56 días, respectivamente. Para Dictyocaulus spp. será preferible esperar hasta que aparezcan larvas de 1º estadío en las heces.

1.6.1.2.- Larvas de cuarto estadío

1. Para evaluar un producto contra larvas de cuarto estadío (L4) en infecciones artificialmente inducidas, el tratamiento debe realizarse respetando los siguientes plazos después de la inoculación del material infectante: 3-4 días para Strongyloides; 5-6 días para Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Cooperia y Dictyocaulus; 3-10 días para Nematodirus; y 15-17 días para Oesophagostomum. Luego del tratamiento, los parásitos restantes en los animales tratados y controles, podrán ser dejados para que maduren, lo que facilitará su recolección durante la necropsia.

1.6.1.3.- Larvas de tercer estadío

1. El tratamiento debe realizarse 2 días después de la infección artificial de los animales para todos los parásitos, excepto Haemonchus, que debe tratarse durante el 1º día. La indicación de uso contra vermes inmaduros debe ser tan exacta como sea posible. Debe referirse al estadío de desarrollo específico del parásito durante el tratamiento. El término general "inmaduro" es aceptable, dado que cubre varios estadíos diferentes del ciclo de vida que a veces no pueden reconocerse. Para establecer normas para estadíos específicos de infecciones inmaduras serán necesarios datos similares a los requeridos para helmintos maduros.

1.7.- Prueba contra larvas inhibidas (tipo II) de Ostertagia spp

1. Para incluir en los rótulos la eficacia contra larvas de 4º estadío hipobióticas o inhibidas de Ostertagia, u otros vermes (ej. Haemonchus) debe seleccionarse un número mínimo de 6 bovinos ó 6 ovinos por tratamiento, con presencia de larvas inhibidas, fenómeno comprobado al final de la prueba, por el hallazgo de estas formas en las necropsias de los controles.

2. Los animales seleccionados para la prueba deben ser confinados para asegurar la no exposición adicional a larvas infectantes de Ostertagia. Después de 3-4 semanas de tal confinamiento, los animales serán tratados, manteniéndose un grupo Control. El sacrificio se hará 4-7 días después del tratamiento. Debe examinarse el abomaso para determinar la presencia de larvas de Ostertagia de 4º estadío inhibidas. Los análisis deben incluir la digestión del órgano o su incubación en solución salina.

3. En la carga del inóculo, se preferirá el uso de larvas de no más de 7-10 días para maximizar su entrada en hipobiosis, mantenidas a temperatura correcta de 4º a 10ºC. La metodología de cultivo, determinación del número de L3 por ml y demás, son de procedimiento standard. La dosis de inóculo (10-20 ml) expresará el número de L3 por especie y por ml de suspensión.

2.- PRUEBA CONTRA CESTODES Y TREMATODES

2.1.-   CESTODES

1. Los animales destinados a pruebas de eficacia contra Moniezia serán considerados infectados al constatarse la presencia de huevos o segmentos en las heces. Cada animal servirá como su propio control.

2. El grupo de tratamiento deberá formarse con por lo menos veinticinco animales. Entre el tratamiento y la necropsia debe transcurrir un período de 12 días, para permitir el crecimiento, y consecuentemente facilitar la recolección e identificación de los escólices no removidos por la acción del medicamento. Solamente estróbilos con escólices o cuellos deben ser contados en la necropsia. La eficacia se analizará estadísticamente comparando el número de segmentos y cabezas con escólices eliminadas en animales tratados frente a los hallados en la necropsia en el mismo animal.

2.2.-   TREMATODES

1. Para la indicación de un fasciolicida contra las diferentes formas de Fasciola hepatica deberán presentarse pruebas con infecciones inducidas con 400 metacercarias en bovinos de una edad entre 12 a 18 meses y 200 metacercarias en ovinos de más de un año de edad .La cantidad de animales por grupo deberá ser como mínimo 6. Estas experiencias deberán demostrar una eficacia contra los parásitos en las siguientes semanas a partir de la infestación:

Inmaduros jóvenes: 1-4  semanas, migración en el parénquima

Inmaduros tardíos: 4-8 semanas, pre-patente en los conductos biliares

Maduros:                 8    semanas en adelante, en los conductos biliares

2. La realización de pruebas de eficacia contra F. hepática de edad inferior a 4 semanas podrá ser efectuada a criterio del laboratorio interesado.

3. Para la evaluación de eficacia contra formas adultas de F. hepática también podrán ser utilizadas infestaciones naturales. Los criterios de inclusión de animales experimentales se basarán en la determinación de huevos en materia fecal.

4. La necropsia para evaluación de la eficacia contra las formas maduras deberá ser hecha después 2-3 semanas del tratamiento. Para las formas inmaduras, la necropsia deberá ser realizada en un período mayor a las 9 semanas post infestación, para que los trematodos  puedan ser más fácilmente identificados y contados.

5. Criterio de eficacia: en pruebas de titulación y confirmación de dosis, la eficacia es determinada comparándose el número de vermes vivos en los animales tratados con el encontrado en los controles. La diferencia debe ser estadísticamente significativa. Cuando se pretenda evaluar  en condiciones clínicas diversas, la eficacia será determinada comparándose los recuentos de huevos en las heces de animales tratados y controles realizadas hasta siete días antes o en el día del tratamiento, con las efectuadas a no menos de tres semanas después. 

Para drogas nuevas o nuevas formulaciones se exigirá prueba de acuerdo a protocolo con necropsias.

Para drogas conocidas, en formulaciones conocidas y con apoyo bibliográfico abundante y coincidente, se aceptará prueba de campo donde se mida eficacia sobre adultos, a través de la presencia de huevos en materia fecal. 

Partiendo de animales positivos a huevos  de Fasciola en materia fecal, se evaluará la evolución post-tratamiento a los 7, 14 y 21 días en forma individual, en comparación a controles sin tratamiento. 

Se sugiere grupos de 20 animales tratados y 20 controles.

El  Método cualitativo a usar puede ser cualquiera de los usados para estos fines.(sedimentación simple, o sedimentación rápida). 

3.- PRUEBAS CLÍNICAS DE CAMPO 

1. Las pruebas clínicas de campo son realizadas básicamente, para proveer evaluaciones sobre moléculas nuevas, formulaciones novedosas o indicaciones adicionales, y para experimentar la seguridad de la droga cuando se aplica en condiciones clínicas diversas.

2. La eficacia debe ser determinada en por lo menos dos regiones climáticas diferentes, de acuerdo a la variabilidad de las condiciones ambientales, de las prácticas de alimentación y manejo y de las muestras de poblaciones de parásitos, incluyendo formas resistentes a otras drogas.

3. Los animales deben ser tratados con la dosis, el modo de administración y la formulación final del producto a ser comercializado. Frecuentemente, en este tipo de experimento, se determina la eficacia antiparasitaria por el recuento de huevos en las heces y en ciertos casos, por el recuento de larvas y diferenciación larval. Por lo menos debe hacerse una evaluación fecal antes del tratamiento y 3 veces después del mismo, por ejemplo: 7º, 14º , y 21º días. El examen de heces en las pruebas para F. hepatica debe efectuarse 21 días después del tratamiento. Deben incluirse en la experiencia un mínimo de 10% de animales controles no tratados. Estos animales deben ser manejados de la misma forma que los animales tratados. Deben obtenerse datos de por lo menos 100 animales tratados en cada una de dos áreas diferentes. En caso de que sean utilizadas más de dos áreas, puede disminuirse el número de animales en cada área. Con todo, se recomienda obtener datos de un total agregado de por lo menos 200 animales tratados. Cualquiera de las técnicas de recuento convencionalmente usada será aceptada, siempre que se mantenga la misma técnica durante todo el experimento. El método usado debe ser descrito juntamente con los otros datos.

4. Los animales que murieran durante cualquier fase de las pruebas deberán ser necropsiados y deberá presentarse un informe completo.

4.- PRUEBA DE EFICACIA PARA ANTI-COCCIDIANOS

4.1.-  Animales

1. En los ensayos de eficacia de anti-coccidianos en vacunos (y en ovinos y caprinos) se emplearán no menos de 6 (seis) animales de 6 – 10 meses de edad, y no menos de 6 (seis) animales con 10 a 16 meses de edad, con una infestación natural determinada por análisis coprológico individual en un grado 4. Un total de 3 (tres) animales elegidos al azar de los dos grupos etarios son tratados con el producto, el resto constituirá el grupo control no tratado. La excreción de Eimeria spp en ambos grupos siempre con análisis coprológico individual será seguido durante 21 días, expresando los resultados de eficacia como el promedio de reducción de ooquistes totales entre los animales tratados y no tratados (de acuerdo a la fórmula expresada en el ítem 1.3, párrafo 7), expresado con un Score de ooquistes hallados.

2. En el caso de ovinos y caprinos, se empleará un grupo de animales jóvenes amamantando y otro destetado, en el mismo número indicado para bovinos.

4.2.- Exámen coprológico

1. Los análisis de ooquistes por gramo se efectuarán usando un método McMaster modificado, con un factor de multiplicación de 50. Se emplea NaCl sobresaturado para estimar el número total de ooquistes. El conteo se realiza en un portaobjetos con una gota de la superficie esparcida, empleando el siguiente score: 

0 sin ooquistes

1 1-10 ooquistes

2 11-50 ooquistes

3 51-100 ooquistes

4 >100 ooquistes

Se deberá individualizar las especies actuantes según claves actualizados (Norton, 1986) (O’Callaghan, 1989), obteniendo los ooquistes mediante método de cultivo y recuperación standard con el objeto de asegurar la presencia de las principales especies actuantes en el país.  

5.- PRUEBAS DE EFICACIA PARA HEMOPARASITICIDAS 

5.1 BABESICIDAS DESTINADOS A BOVINOS

1. ANIMALES: Se requiere un mínimo  de 12 animales susceptibles para ser infestados con  Babesia bovis y Babesia bigemina, los que se distribuyen en 2 grupos de 6 animales en cada uno (control y tratado)..

2. .EDAD: Deberán ser mayores de 12 meses. 

3. INMUNODEPRESIÓN: Con la esplenectomía se logra una inmunodepresión conocida. En el caso de emplear corticoides, en el protocolo que se presenta a evaluación deben especificarse cuál se empleará, a que dosis y tiempo de duración del tratamiento para lograr inmunodeprimir a los animales. 

4. INOCULO: todos los animales serán inoculados con cepas virulentas en cada caso con el correspondiente parásito (B. bovis o B. bigemina)..Los inóculos serán de 1 x 108 hematíes parasitados por B. bovis y de 1 x 106 - hematíes parasitados por B. bigemina.

5.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

1. Para cada parásito se trabajará con seis animales inmunodeprimidos y seis animales normales, sin inmunodepresión, Estos doce animales serán divididos en grupos de animales, de acuerdo al siguiente esquema

GRUPO I - 2 terneros inmunodeprimidos y 2 normales, inoculados con B. bovis serán tratados con el producto cuando fueren detectados los parámetros clinicos y de laboratorio que denoten la enfermedad

GRUPO II - 1 ternero inmunodeprimido y 1 normal, inoculados con B. bovis, son mantenidos como control no medicado.

GRUPO III - 2 terneros inmunodeprimidos y 2 normales, inoculados con B. bigemina, serán tratados cuando fueren detectados los parámetros clínicos y de laboratorio que denoten la enfermedad

GRUPO IV - 1 ternero inmunodeprimido y 1 normal, inoculados con B. bigemina, son mantenidos como control no medicado.

5.3 CRITERIO DE EFICACIA

Aceptación de prueba: los animales que integran el grupo control deben presentar como mínimo el 60% con “Manifestación severa”.

La prueba es considerada satisfactoria cuando el 95% de animales tratados permanecen vivos.

PARAMETROS  PARA EVALUAR EN PRUEBAS DE EFICACIA*

1. período de incubación. Número de días desde el inóculo hasta el primer día de fiebre, expresado en promedio ± error estándar.

2. período prepatente. Número de días desde el inóculo hasta la aparición de los primeros eritrocitos parasitados en frotis de sangre periférica, expresado en promedio ± error estándar.

3. máximo porcentaje de disminución del hematocrito. Expresado como valor promedio de máxima disminución del hematocrito por debajo de los valores promedios pre-inóculo ± error estándar.

4. días de anemia. Número de días con una disminución del hematocrito igual o superior al 50% respecto a los valores promedio pre-inóculo ± error estándar.

5. parasitemia. Máximo porcentaje de parasitemia expresado como valor promedio del grupo ± error estándar

DEFINICIÓN DE “MANIFESTACIÓN SEVERA”

Dado que la parasitemia depende de las características de cada cepa del inóculo, la presencia de parásitos deberá estar acompañada por otro parámetro (hematocrito o temperatura). 

Previo a la prueba se debe tener los valores de hematocrito de tres días anteriores al inóculo y con respecto al valor de temperatura se deberá tomar siempre a la misma hora y los grados de diferencia es en relación a la temperatura de animales sin inocular.

Parámetro B.bigemina B.bovis

Parasitemia 0,5 a 5% 0,1 a 0,5%

Hematocrito 50% de reducción (mínimo durante 2 días) 50% de reducción(mínimo durante 2 días)

Aumento de temperatura 1,5 ºC por 2 días 1,5 a 2 ºC por 2 días

Evidencia de gravedad Hemoglobinuria Síntomas nerviosos

6.- EFICACIA DE PRODUCTOS DE ACCIÓN PROLONGADA

1. Una determinada formulación de un antiparasitario es considerada de acción prolongada cuando en comparación con otra formulación convencional con la misma droga activa, mantuviere un nivel plasmático terapéutico, o actividad antiparasitaria, por un período de tiempo mayor. 

2. La acción prolongada del antiparasitario debe ser comprobada con referencias bibliográficas oficiales o científicas internacionalmente reconocidas o por experimentación propia o en institutos de investigación reconocidos llevada a cabo con metodología científica aceptada. Incluirá ensayos controlados de farmacocinética y farmacodinamia con protocolos aprobados previamente, en animales con infestación inducida, donde los resultados expresarán el número de parásitos hallados en la necropsia en grupos tratados y no-tratados.

3. El siguiente cuadro detalla los días de infestación con un cultivo mixto de no menos de 60.000 Larvas infestantes de tercer estadío, en terneros menores de un año de edad, de un mismo sexo y raza, alojados individualmente en boxes individuales.

Grupos Días previos al tratamiento

42 35 28 21 14 7 0

I X T

II X T

III X T

IV X T

V X T

VI X T

Referencias: X: infestación experimental; T: tratamiento

Necropsias: Días 28 y 29 post-tratamiento.

4. La recolección y conteo de todos los estadíos adultos y larvarios de abomaso, intestinos (grueso y delgado), y pulmón, se hará siguiendo metodología standard. (Eddi et al, INTA. Castelar, 1993).

5. Se considerará válido un período determinado cuando la reducción con respecto a los controles es igual o mayor al 90% (efectivo) y 98% o superior, altamente efectivo (Ítem 1.4 – Párrafo 34).

6. La alteración del nivel plasmático terapéutico puede ser derivada de la modificación favorable de la estructura química, del empleo de recursos farmacotécnicos o farmacológicos o que actúen sobre la farmacocinética del antiparasitario.

7. La existencia, en una especialidad farmacéutica, de sustancias activas con y sin acción prolongada obliga a la clasificación del producto en esta última categoría.

8. El uso de la denominación larga acción, acción prolongada, o acción profiláctica para productos antiparasitarios, podrá ser solicitado por las firmas registrantes luego de dar cumplimiento a lo dispuesto en el párrafo 67.

7.-  DISPOSICIONES GENERALES

1. Para drogas nuevas, cuyas características y mecanismo de acción impliquen una nueva metodología de ensayo y evaluación, y que por consiguiente no estén contenidas en este reglamento, se aceptará la metodología propuesta por el propietario de la molécula, luego del análisis y evaluación por parte del organismo oficial de registro.

2. Cuando las formulaciones de los productos antiparasitarios que tengan indicaciones de uso incluidas en la presente reglamentación presentaran alguna innovación técnica, o contengan principios activos sobre los cuales no haya suficiente información bibliográfica, las pruebas de eficacia obligatoria deberán ser avaladas por técnicos pertenecientes a instituciones reconocidas por el órgano oficial de registro.

3. En el caso de formulaciones conocidas internacionalmente y que contengan principios activos ampliamente estudiados, y con resultados publicados en la bibliografía, solamente será obligatorio la realización de pruebas de reducción de HPG con infestación natural, cuyos protocolos hayan sido previamente evaluados y aprobados por el organismo oficial de registro, el cual deberá ser informado con una anticipación mínima de 15 días de: a) fecha en que se iniciará la realización de la prueba; b) lugar en que será realizada la prueba; y c) nombre y matrícula habilitante del Médico Veterinario responsable a cargo de la prueba. Se sugiere el siguiente protocolo para nematodes

7.1.-  Prueba de campo

1. ANIMALES: Dos grupos con un mínimo de 10 ovinos o 6 bovinos naturalmente infectados y mantenidos a campo, serán examinados en el día 0 y se les tomarán muestras fecales para determinación del número de huevos por gramo de heces (HPG) y realización de coprocultivos. Para ser incluidos en la prueba, el HPG mínimo deberá ser de 500 para ovinos y 300 para bovinos. Un grupo será mantenido como control y el otro será tratado con el producto en prueba. Se efectuarán nuevos exámenes individuales de heces (HPG) y coprocultivo en el 10º día después del tratamiento. Para determinar la eficacia del producto con relación a la reducción del número de huevos por gramo de heces, deberá ser empleada la siguiente ecuación:

1-(T2 ÷ T1) X (C1 ÷ C2) X 100,

Donde T2 = media de HPG del grupo tratado en el 10º día después del tratamiento;

T1= media de HPG del grupo tratado en el día 0;

C1 = media de HPG del grupo control en el día 0;

C2= media de HPG del grupo control en el 10º día del experimento.

REGLAMENTO TÉCNICO

PRUEBAS DE EFICACIA PARA REGISTRO DE ANTIPARASITARIOS

INTERNOS PARA PORCINOS

1.- PRUEBA CONTROLADA

1. Este ensayo controlado es el único válido en los monogástricos. Los resultados de una prueba crítica se pueden adjuntar, pero solo como soporte de la Prueba controlada.

1.1. Diseño de prueba

1. Los animales (mínimo de 6 cerdos de aproximadamente de un año de edad por cada Grupo, Tratado y Control sin tratar, con asignación de grupo al azar) serán sacrificados y realizada la necropsia entre el día 5 y 7 post-tratamiento, pero este período puede extenderse ante una justificación farmacocinética aceptable. Se hará el recuento de parásitos de estadío adultos y larvarios del tracto gastrointestinal, riñón, hígado y pulmón, siguiendo un protocolo con metodología aprobada de laboratorio.  

2. El número mínimo de infestación de cada especie de nematode dependerá de la especie, y se basará en la información del informe final con sus datos estadísticos e históricos, bibliografía o informes de especialistas. Generalmente, se considera que una media de 100 parásitos adultos de una especie dada es la infestación mínima adecuada para determinar la eficacia de una droga. En los casos de A.suum, A.strongylina, Pysochephalus sexalatus, Stephanurus dentatus, Metatrongylus spp y Fasciola spp deben esperarse medias inferiores.

3. En el caso de buscar establecer eficacia contra Stephanurus dentatus se emplearán animales adultos.

4. En el caso de utilizarse infestación artificial, procedimiento indicado para los estudios de determinación de dosis y para ensayos de control prolongado, se utilizarán los siguientes números mínimos de larvas infestantes:

Número mínimo de larvas infestantes viables para la infestación experimental.

Parásito Rango

Estómago

Ascarops strongylina 200

Hyostrongylus rubidos 1.000 – 4.000

Physocephalus sexalatus 500

Intestinos

Ascaris suum 250 – 2.500

Oesophagostomum spp 2.000 – 15.000

Strongyloides ransomi 1.500 – 5.000

Trichuris suis                                                     1.000 – 5.000

Pulmones 

Metastrongylus spp          1.000 – 2.500

Riñón

Stephanurus dentatus         1.000 – 2.000

1.2 Momento del tratamiento

1. Para la eficacia ante el estadío adulto el tratamiento no debe administrarse antes de los 35 días de administrada la infestación experimental con Ascarops strongylina, 26 días para Hyostrongylus rubidus, 55 días para Pysochephalus sexalatus, 65 días para Ascaris suum, 10 días para Strongyloides ransomi, 28 a 45 días para Oesophagostomum dentatum y O.quadrdispinulatum, 50 días para Trichuris suis, 35 días para Metastrongylus spp. y 10 meses para Stephanurus dentatus. 

2. Para larvas (L4) los tratamientos se darán en general entre 7 y 9 días luego de la infestación, con las siguientes excepciones; 3 a 4 días para Strongyloides ransomi, 11 a 15 días para Ascaris suum y 16 a 20 días para Trichuris suis.

3. En el caso especial de la eficacia frente a la transmisión transmamaria de larvas somáticas de Strongyloides ransomi,  cerdas preñadas con infestación natural o inducida deberán ser tratadas previo al parto y la eficacia comprobada mediante el recuento de larvas en la leche de la cerda y los adultos en el intestino delgado de la camada.

1.3 Metodología de necropsia

1. La metodología empleada en la necropsia para la búsqueda parasitológica de las formas adultas y larvarias es la considerada standard para cerdos. En general seguirá las siguientes pautas:

2. El tracto digestivo es separado y los diferentes segmentos aislados y atados en sus puntas. Luego se guarda el contenido de cada segmento antes de lavar la mucosa cuidadosamente para separar todos los parásitos libres. El contenido inicial y el producto de los lavados son mezclados. Para la evaluación de la eficacia frente a especies “pequeñas”, las alícuotas se tomarán antes que el contenido total sea examinado para las especies consideradas “grandes”.

3. Se podrán emplear métodos de digestión usando una solución de HCl/pepsina para la búsqueda y recolección de formas inmaduras.

4. Estómago: Una vez abierto, el contenido es decantado y lavado sobre una malla. Todos los parásitos recuperados son identificados y contados. Luego de la inmersión en solución fisiológica salina durante 4 a 6 horas o durante una noche, a 38º - 40º , se examinará la mucosa y el sedimento para Ascarops, Hyostrongylus y Physocephalus. 

5. Intestino delgado: La mayoría de Ascaris pueden ser juntados y contados una vez abierto el intestino. Se facilita la recolección de Strongyloides ransomi mediante la digestión, inmersión en solución salina tibia o con raspados de la mucosa.

6. Intestino grueso y ciego: Se mezcla el contenido de ambos segmentos junto a los lavados de mucosa, y se toman alicuotas cuando los recuentos aparentemente superen varios cientos de ejemplares de Oesophagostomum. Las superficies lavadas se deben examinar bajo lupa para hallar Trichuris que en general están firmemente adheridos a la mucosa.

7. Pulmones y traquea: Los nematodes pulmonares tienden a estar en conglomerados en los bronquios distales. Los cortes de los pulmones comenzarán en la traquea y seguirán por los bronquios y bronquiolos.

8. Stephanurus dentatum: Aunque el habitat normal de los adultos es un quiste que tiene una fístula a un ureter, pueden ser hallados enquistados o libres en otras partes del cuerpo animal. Las formas inmaduras se encontrarán en general en los nódulos linfáticos mesentéricos (L3 y L4 inicial) y en el hígado (L4 avanzado y L5 inicial).

9. Se recomienda mantener los cerdos durante un período mínimo de 6 a 8 semanas post-tratamiento, que permite el desarrollo de las formas inmaduras, migrar al hígado y seguir su ciclo biológico. La mejor producción de huevos se hallará en la primera orina luego que la cerda ha sido encerrada durante toda la noche.

10. Se recomienda la cuidadosa inspección de todos los órganos, paredes de la cavidad torácica y hasta los músculos inmediatos, para el hallazgo de larvas migratorias o con enquistamiento aberrante. Incluirá también la grasa perirenal, tejidos circundantes y los riñones para la búsqueda del estadío adulto.

11. Los estadíos larvarios L4 y L5 se podrán encontrar en los vasos sanguíneos y parénquima hepáticos. Contar todos los ejemplares y registrar su localización y grado de desarrollo.

1.4 Cálculo de Eficacia y Análisis Estadístico

1. Los test de hipótesis de eficacia se efectuarán para un nivel de confianza del 95% (<0.05), redondeando los números en los resultados logrados en todos los cálculos matemáticos. Con la cantidad de parásitos de cada especie de nematode hallada se calcula la media geométrica (MG) de cada especie parasitaria.

2. El porcentaje de reducción (eficacia) de la cantidad de nematodes (PR) se calcula a través de la siguiente fórmula (Power et al, 1982):

PR = [(MG) Controles – (MG) Tratados) ./. (MG)Controles] x 100.   

MGC = media geométrica en el grupo control

MGT = media geométrica en el grupo tratado

3. Esta fórmula fue desarrollada originalmente utilizando la media aritmética. No obstante, para suinos, en la mayor parte de los casos y con un mínimo de seis animales por grupo, se indica el uso de la razón geométrica, en lugar de la media aritmética. Esto dependerá, sobretodo, de que los recuentos de vermes tengan o no una distribución normal. En general, con el uso de la media aritmética se precisa mayor cantidad de animales que la geométrica.

4. En un test de eficacia de un antiparasitario interno, el análisis estadístico de datos que no poseen una distribución normal (ejemplo: número de parásitos, valores de pH) determinado por el procedimiento univariado de SAS (Staystical Analysis System), los datos se compararán a través del test de Kruskal-Wallis (aproximación Chi2). La comparación de las diferencias entre los grupos se llevará a cabo usando el test de comparaciones múltiples no paramétrico de Dunn (Hollander & Wolfe, 1973) o similar.

1.5.- Evaluación de la Prueba controlada

1. La eficacia será evaluada de acuerdo al siguiente criterio:

Altamente efectivo > 98%

Efectivo 90-98%

Ayuda en el control 80-89%

Insuficientemente activo < 80% (no registrable)

2. No se admitirá usar el término global de “inmaduros” en los resultados. 

2.- ENSAYOS CRÍTICOS

1. Los ensayos críticos son realizados básicamente, para proveer evaluaciones sobre moléculas nuevas, formulaciones novedosas o indicaciones adicionales, y para experimentar la seguridad de la droga cuando se aplica en condiciones clínicas diversas.

2. La eficacia es determinada mediante el recuento de huevos en materia fecal y/o orina, en algunos casos con soporte del recuento de larvas diferenciadas por especie.

3. Cada estudio incluirá no menos de 4 (cuatro) animales tratados y uno (1) sin tratar.

4. La información acumulada deberá ser de un mínimo de 100 cerdos tratados en cada una de las áreas geográficas (mínimo dos).

3.-  DISPOSICIONES GENERALES

1. Para drogas nuevas, cuyas características y mecanismo de acción impliquen una nueva metodología de ensayo y evaluación, y que por consiguiente no estén contenidas en este reglamento, se aceptará la metodología propuesta por el propietario de la molécula, luego del análisis y evaluación por parte del organismo oficial de registro.

2. Cuando las formulaciones de los productos antiparasitarios que tengan indicaciones de uso incluidas en la presente reglamentación presentaran alguna innovación técnica, o contengan principios activos sobre los cuales no haya suficiente información bibliográfica, las pruebas de eficacia obligatoria deberán ser avaladas por técnicos pertenecientes a instituciones reconocidas por el órgano oficial de registro.

3. En el caso de formulaciones conocidas internacionalmente y que contengan principios activos ampliamente estudiados, y con resultados publicados en la bibliografía, solamente será obligatorio la realización de pruebas de reducción de HPG con infestación natural, cuyos protocolos hayan sido previamente evaluados y aprobados por el organismo oficial de registro, el cual deberá ser informado con una anticipación mínima de 15 días de: a) fecha en que se iniciará la realización de la prueba; b) lugar en que será realizada la prueba; y c) nombre y matrícula habilitante del Médico Veterinario responsable a cargo de la prueba. Se sugiere el protocolo siguiente para el caso de nematodes:

3.1.-  Prueba de campo

1. ANIMALES: Dos grupos con un mínimo de 10 porcinos naturalmente infectados y mantenidos en condiciones normales de crianza, serán examinados en el día 0 y se les tomarán muestras fecales para determinación del número de huevos por gramo de heces (HPG) y realización de coprocultivos. Un grupo será mantenido como control y el otro será tratado con el producto en prueba. Se efectuarán nuevos exámenes individuales de heces (HPG) y coprocultivo en el 10º día después del tratamiento. Para determinar la eficacia del producto con relación a la reducción del número de huevos por gramo de heces, deberá ser empleada la siguiente ecuación:

1-(T2 ÷ T1) X (C1 ÷ C2) X 100,

Donde T2 = media de HPG del grupo tratado en el 10º día después del tratamiento;

T1= media de HPG del grupo tratado en el día 0;

C1 = media de HPG del grupo control en el día 0;

C2= media de HPG del grupo control en el 10º día del experimento.

Bibliografía

Mercosur, documento armonizado de aprobación de productos veterinarios, 1998. (Archivo SENASA, Buenos Aires).

Power, K., Wood, I., Eckert, J., Gibson, T., and Smith, HJ. (1982). WAAVP Guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in ruminants (bovine and ovine). Vet.Parasitology, 10:265-284.

Düwel, D., Barth,D.W., Batte, E.G., Berger, H., Stewart, T.B., and Theodorides, V.J. (1986). WAAVP Guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in swine. Veterinary Parasitology, 21 : 69-82.

VICH Internat.Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Vet.Medical Products, Document VICH GL 16 (Anthelmintics Porcine), Speific Recommendations for porcines, June 2001.

Bulman, G.M., Caracostantógolo, J., Eddi, C.S., Ambrústolo, R.R., Muñoz Cobeñas, M.M., Morley, M.E. y Shapiro, J. (1995). El control prolongado de los anthelmínticos, concepto, realidad e importancia de esta acción frente a los parásitos bovinos y ovinos. Veterinaria Argentina, Vol XII, 113, mayo : 6-8.

Bulman, G.M. (1993). Boletín Técnico Nº4, Cyanamid de Argentina, S.A.

Eddi, C.S. (1996). Comparative persistency efficacy of doramectin, ivermectin and fenbendazole against naturally acquired nematode infections in cattle. Symposium, XIX World Buiatrics Congress, Edinburgh (Scotland, UK), July 1996.

Wood, Y., Amaral, N.K., Bairden, K., et al (1995). WAAVP IInd. Edition of Guidelines for the evaluation of the efficacy of anthelmintics (Bovine, ovine and caprine). Veterinary Parasitology, 58: 181-213.

Técnicas de necropsia y de laboratorios aplicadas en el CICV, INTA, Castelar. (1982) Publicación anónima, cortesía de Johnson & Johnson, Div.Veterinaria. 

Mangold, A. (2004). Comunicación personal. Laboratorio de hemoparásitos, INTA, Rafaela (Argentina).

Svennson, C. (1998). Prevention of E.alabmensis coccidiosis by a long-acating bolus. Vet.Parasitologyu, 74 : 143-152.

Borgsteede, F.H.M., Dercksen, D.P. (1996). Coccidial and helminth infections in goats kept indoors in the Netherlands. Vet.Parasitology 61 : 321-326.

“Protocolo para evaluar la seguridad y eficacia de los inmunógenos contra la anaplasmosis y babesiosis bovina” GAN – 47, Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe, Santiago, Chile (1994).