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GUIA PARA O CÁLCULO DO PERÍODO DE CARÊNCIA EM TECIDOS COMESTÍVEIS

Maio 2011

Revisão: Maio 2013

Segunda Revisão: Dezembro 2013

GUIA PARA O CÁLCULO DO PERÍODO DE CARÊNCIA EM TECIDOS COMESTÍVEIS 

Tabela de Conteúdos

1. Introdução 2

2. Glossário 2

3. Alcance do guia 6

4. Estimativa do período de carência 6

4.1. Modelo estatístico 6

4.1.1. Banco de dados 7

4.1.2. Supostos da análise de regressão linear 8

4.1.2.1. Homogeneidade de variâncias (homocedasticidade) 8

4.1.2.2. Linearidade do ln dos dados experimentais 8

4.1.2.3. Normalidade dos erros 8

4.1.3. Procedimento estatístico baseado no LMR 9

4.1.4. Procedimento alternativo baseado no LMR 10

4.2. Tempo de carência estimado a partir dos resíduos no local de injeção 10

4.2.1. Interpretação 11

4.2.2. Princípios gerais 11

4.2.3. Desenho do estudo e coleta de amostras 11

4.2.4. Procedimento baseado no LMR 12

4.2.5. Procedimento baseado na IDA 12

4.2.6. Procedimento baseado no limite de exposição alternativo 14

5. Referências 18

6. Anexo 19

1. Introdução

A segurança do consumidor precisa ser resguardada através da valoração de todas as substâncias farmacologicamente ativas destinadas a serem usadas em animais produtores de alimentos. Os períodos de carência são determinados com o objetivo de assegurar que os resíduos de tais substâncias nos tecidos comestíveis se reduzam até concentrações permitidas. 

Enquanto o limite máximo de resíduos (LMR) para um determinado tecido é aplicado para o princípio ativo em si mesmo, o período de carência é determinado de forma individual para cada medicamento veterinário como parte do processo de autorização de comercialização.  

O princípio ativo incluído no medicamento veterinário que é administrado aos animais produtores de alimentos não necessariamente é a substância que estará presente nos produtos comestíveis. Os sistemas enzimáticos ou fluidos fisiológicos de um animal podem agir sobre esse princípio ativo administrado e produzir novas substâncias como metabolitos que podem ser tanto ou mais nocivos para o consumidor do que o princípio ativo original. A concentração destas substâncias nos produtos comestíveis de origem animal será em função da velocidade e do grau de absorção do agente farmacológico original, a velocidade do metabolismo e a taxa de excreção tanto do princípio ativo original quanto de seus metabolitos. Portanto, o resíduo total do agente farmacológico administrado nos animais tratados estará composto pelo princípio ativo original, metabolitos livres e metabolitos que estão unidos a moléculas endógenas. 

Devido a que os diferentes componentes dos resíduos totais podem diferir em seus potenciais toxicológicos, é que se deve fornecer informação sobre a natureza química, a quantidade e a persistência dos resíduos totais nos tecidos comestíveis dos animais que foram objeto do tratamento. 

A forma mais simples e prática de determinar o período de carência tem sido a de identificar o momento em que as concentrações permanecem abaixo do LMR em todos os tecidos monitorados de todos os animais experimentais. Em alguns casos, e quando existe uma variabilidade marcada entre os dados de eliminação, é de praxe acrescentar um período como fator de segurança. 

Em alguns casos, foram utilizados métodos estatísticos que, de ser aceitos de forma generalizada, gerariam uma grande oportunidade de harmonização. 

A escolha do método estatístico a ser utilizado é responsabilidade do solicitante e, em qualquer caso, deverá estar devidamente justificado com documentos adequados. 

Neste guia, são descritos os procedimentos padronizados para poder estabelecer o período de carência apropriado para cada princípio ativo associado a uma forma farmacêutica, dose e via de administração proposta para uma determinada espécie animal, a fim de garantir a segurança do consumidor. 

2. Glossário

Cesta básica de alimentos padrão: É uma estimativa da quantidade total de alimento de origem animal que é consumida diariamente por um adulto de 60 kg. A cesta básica de alimentos utiliza valores arbitrários de consumo baseadas nos percentis superiores da ingestão diária de alimentos de origem animal. 

Os valores de consumo diário de alimentos de origem animal são:

Para mamíferos: 

300 g de músculo, 50 g de gordura ou gordura e pele, 100 g de fígado e 50 g de rim.

Para aves: 

300 g de músculo, 90 g de gordura e pele, 100 g de fígado e 10 g de rim.

Para peixes: 

300 g de músculo e pele em proporções naturais

Também, considera-se um consumo de 1,5 l de leite, 100 g de ovos e 20 g de mel.

A estimativa do risco de consumo de resíduos presentes em uma cesta básica de alimentos é feita considerando a IDA. 

Princípio ativo – Agente Farmacológico (do inglês API: Active Pharmacological Ingredient): É toda substância que pode ser utilizada para a cura, mitigação, tratamento, prevenção ou diagnóstico das doenças do homem ou dos animais. 

Ingestão Diária Aceitável (IDA): É a estimativa do resíduo, expresso em termos de unidades de peso por quilograma de peso vivo (kg/pv), que pode ser ingerido diariamente durante toda a vida, sem risco apreciável para a saúde do consumidor. 

Intervalo de confiança: Valores entre os quais se espera achar, com certo grau de certeza, o valor de um parâmetro populacional. 

Limite Máximo de Resíduo (LMR): É a concentração máxima de resíduos presentes nos géneros alimentícios e subprodutos animais que não envolvem riscos para a saúde do consumidor, com base em fatos conhecidos no momento de sua recomendação. (Definição CAMEVET)

Limite de quantificação (LOQ): É a menor concentração de um analito, cuja presença pode ser determinada com um grau específico de precisão e exatidão, dentro dos limites estatísticos estabelecidos.

Limite de detecção (LOD): É a menor concentração de um analito que pode ser detectado, mas não quantificada em uma amostra dentro dos limites estatísticos estabelecidos.

Limites de tolerância: São os valores extremos de uma série de valores (intervalo) entre os quais se espera achar, com certo grau de certeza, uma determinada porcentagem dos indivíduos de uma população determinada. 

Medicamento veterinário: Toda substância química, biológica, biotecnológica ou preparação manufaturada (elaborada) que se administra de forma individual ou coletiva, direta ou misturada com os alimentos, destinada à prevenção, cura ou tratamento das doenças dos animais. 

Período de Carência – Período de Retirada – Restrição de Uso – Período de Supressão: Período de tempo mínimo que deve decorrer entre a última aplicação de um medicamento veterinário a um animal, nas condições normais de emprego, e a obtenção de produtos alimentícios desse animal, para garantir que tais produtos alimentícios não contenham resíduos em quantidades que superem os limites máximos estabelecidos. 

Produto Veterinário (definido segundo CAMEVET): Entende-se por produto veterinário toda substância química, biológica, biotecnológica ou preparação manufaturada cuja administração, seja individual ou coletiva, diretamente administrada ou misturada com os alimentos ou água de bebida, destinada à prevenção, diagnóstico, cura ou tratamento das doenças dos animais, incluindo aditivos, suplementos, promotores, melhoradores da produção animal, antissépticos, desinfetantes de uso ambiental ou em equipamentos e ectoparasiticidas e qualquer outro produto que, utilizado nos animais e no seu habitat, proteja restaure ou modifique suas funções orgânicas e biológicas. Compreende também os produtos destinados ao embelezamento dos animais.

Resíduo marcador: É um analito confiável para determinar a presença de resíduos de um determinado principio ativo em um tecido. O resíduo marcador pode ser a molécula mãe ou qualquer um de seus metabolitos, produtos de degradação ou uma combinação de qualquer um destes. O marcador também pode ser um derivado químico de um ou vários dos componentes do resíduo. A relação entre o resíduo marcador e a concentração dos resíduos de interesse nos tecidos comestíveis deve ser conhecida (resíduo marcador/ resíduos de interesse). O LMR reflete a maior concentração permitida do resíduo marcador nos tecidos comestíveis. 

Resíduo total: Trata-se da fração do medicamento original juntamente com qualquer dos metabolitos e produtos a partir deste medicamento, que permanecem no alimento então a medicação fornecida para produção de alimentos de animais.

O total de resíduos normalmente inclui todos os resíduos relacionados ao agente farmacológico (molécula mãe junto com seus metabolitos) e, na maior parte dos casos, é idêntica à totalidade de resíduos determinada por estudos de depleção tecidual radiométricos. 

Resíduos de importância toxicológica: Para fazer a estimativa de uma exposição baseada em uma IDA toxicológica, o resíduo de interesse é o resíduo de importância toxicológica. Este inclui normalmente todos os compostos relacionados com a molécula (molécula mãe com os metabolitos) e, na maior parte dos casos, é idêntica à totalidade de resíduos determinada por estudos de depleção tecidual radiométricos. Contudo, se for demonstrado que um componente do resíduo ou uma fração da totalidade dos resíduos é toxicologicamente inativo, é possível descontá-la do resíduo total ou de qualquer outra fração de resíduos que não seja biodisponível por via oral ou de metabolitos dos quais já se sabe que são toxicologicamente inativos.

Resíduos de interesse farmacológico: Para fazer a estimativa de uma exposição baseada em uma IDA farmacológica, o resíduo de interesse é o resíduo de importância farmacológica. Normalmente, é considerada a molécula mãe mais qualquer outro resíduo da mesma. Diante da ausência de dados sobre atividade farmacológica dos componentes do resíduo total, admite-se que o total de resíduos apresenta a mesma atividade farmacológica que a molécula mãe.

Resíduos de interesse microbiológico: Para fazer a estimativa da exposição baseada em uma IDA microbiológica, o resíduo de interesse é o que tem importância microbiológica. Na maior parte dos casos, é idêntico aos resíduos que são determinados em ensaios microbiológicos. Diante da ausência de tais dados, pode ser usado o resíduo total ou, alternativamente, a soma dos componentes individuais dos quais já se sabe apresentam atividade microbiológica. Portanto, admite-se que a atividade microbiológica do resíduo total ou dos metabolitos e/ou produtos de degradação é igual à molécula mãe. 

Local da injeção: É uma área do tecido na qual o medicamento veterinário foi injetado. As amostras de tecido obtidas dos locais de injeção para a realização de estudos de resíduos devem ser representativas do que, com probabilidade, será selecionado como tecido comestível nos procedimentos de abate. A amostra de tecidos deverá incluir tecido muscular, tecido conectivo e gordura subcutânea em proporções naturais (o recorte das amostras para eliminar o tecido conectivo e a gordura aderida ao músculo é considerado um procedimento artificial que se afasta da situação real). Os locais de injeção não devem incluir a porção de pele que os cobre, já que a mesma não é requerida para a análise dos resíduos. 

Tecido: Todo tecido animal comestível, inclusive músculos e subprodutos (Definições estabelecidas e adotadas pelo Comitê Misto FAO/OMS de Peritos em Aditivos Alimentares - JECFA).

3. Alcance do guia

Este guia é uma recomendação para o cálculo de períodos de carência adequados para tecidos comestíveis provenientes de animais produtores de alimentos quando a eles se administra um medicamento veterinário (MV) determinado, em uma tentativa de harmonizar a metodologia utilizada internacionalmente para esses fins. Este guia também coloca a ênfase na determinação do tempo de carência pelo método estatístico baseado no limite máximo de resíduos (LMR), que é considerado de primeira escolha. 

 O guia não tem como alcance o cálculo de períodos de carência em outros produtos de origem animal como leite, ovos, mel e produtos de aquicultura, já que estes requerem uma outra consideração. 

Procedimentos descritos:

- Procedimento estatístico baseado no LMR

- Procedimento alternativo baseado no LMR.

- Tempo de carência pré-abate estimado a partir dos resíduos no local de injeção 

Os estudos de resíduos mencionados devem incluir a descrição e a validação dos métodos analíticos (ver Guia 2: “Guia para a Validação de Métodos Analíticos para a Determinação de Resíduos em Matrizes Biológicas”).

Para o desenho experimental da fase animal, recomenda-se ver o Guia 1 “Guia técnico para a Condução de Estudos de Metabolismo e Cinética de Resíduos de Agentes farmacológicos de Uso Veterinário em Animais Produtores de Alimentos”

4. Estimativa do período de carência

4.1. Modelo estatístico

O cálculo do período de carência mediante o método estatístico se baseia em princípios aceitos de farmacologia básica. Tomando como base um modelo farmacocinético de um compartimento, a relação entre a concentração de um princípio ativo e o tempo durante as fases de absorção, distribuição e eliminação, pode ser descrita por termos matemáticos multi-exponenciais. Entretanto, a eliminação da substância e/ou metabolitos a partir dos tecidos dá lugar a uma curva de concentrações teciduais que segue um declínio exponencial de ordem um, que pode ser adequadamente descrito por um modelo de um compartimento com um só termo exponencial. A equação de primeira ordem aparente que descreve a cinética de depleção tecidual é a seguinte:

Ct = C0 e-kt

onde Ct  é a concentração tecidual em um tempo dado, C’0 é o termo pré-exponencial, e é a base dos logaritmos naturais, k é a constante de primeira ordem aparente de eliminação e t é o tempo. 

O termo C0 representa o ponto de interseção no eixo da ordenada a tempo zero, o mesmo é, na verdade, só uma concentração teórica necessária para o ajuste dos dados experimentais com o modelo de um só termo exponencial . Por pertencer a uma equação que descreve uma função exponencial decrescente, a constante leva sinal negativo. 

A linearidade do gráfico do logaritmo natural das concentrações teciduais em função do tempo (ln Ct vs t), proporciona evidência de que o modelo de um termo exponencial é aplicável e que a análise estatística de regressão linear dos dados transformados logaritmicamente pode ser considerada como método confiável para a estimativa do período de carência. Nesse caso, os dados experimentais podem ser descritos pela equação de primeiro grau, também conhecida como equação geral de uma reta que está dada pela seguinte expressão:

y = a + bx

onde y é um valor sobre o eixo da ordenada, x é um valor no eixo da abscissa, a é o ponto onde a reta cruza o eixo da ordenada e b indica a quantidade com a qual y muda por cada unidade de mudança em x. O valor de a é conhecido como ordenada na origem y o valor de b como pendente da reta.

O procedimento utilizado para obter a reta desejada é conhecido como método de quadrados mínimos, e a reta resultante (melhores valores médios estimados em cada ponto da amostragem) é conhecida como reta de quadrados mínimos. 

4.1.1. Base de dados

A análise de regressão linear requer que os dados experimentais sejam independentes uns dos outros. Em geral, os dados de depleção tecidual reúnem esta condição devido a que surgem de indivíduos diferentes. 

Caso se disponha de medições em duplicata ou triplicata de concentrações teciduais de uma única amostra, será utilizado o valor médio para a realização da análise de regressão linear . 

Para evitar o erro no cálculo da pendente e o ponto de interseção, cada dado de concentração tecidual deverá surgir, sempre que for possível, do mesmo número de medições repetidas. 

Como indicação geral, de acordo com a espécie animal, deveriam ser utilizados entre 4 e 10 animais por ponto de amostragem (dia de abate). Um esquema básico seria contar com dados de concentrações teciduais de 16 (dezesseis) animais, os quais seriam abatidos em grupos de 4 (quatro) indivíduos em 4 (quatro) dias de abate convenientemente distribuídos. 

Dados experimentais de concentração de tecido caindo acima do limite de deteção (LOD) e abaixo do limite de quantificação (LOQ) tem valor informativo, se não estritamente quantificável valor. Portanto, se for necessário usá-los, eles serão considerados valores opcionais e seu fato de uso deve ser devidamente justificado.

Devem ser excluídos da análise os dados experimentais reportados como menores ao LOD.

Quando todos ou alguns dos dados experimentais reportados em um dia de abate forem “opcionais”, deverá ser considerada a possibilidade de excluir da análise o tempo de abate correspondente. É preciso levar em conta que existe a necessidade de um mínimo de três pontos de amostragem (dias de abate) determinados durante a fase de eliminação terminal e um mínimo de três amostras (animais) por ponto de amostragem para poder realizar uma análise de regressão linear. 

Os dados experimentais de concentração tecidual devem ser reportados tal qual foram quantificados, isto é, sem ser corrigidos pelos valores de recuperação da técnica analítica, os quais devem ser anexados aos dados dos experimentos de recuperação e o fator de correção que deriva deles. Neste caso, antes de realizar a análise de regressão linear, os dados experimentais devem ser corrigidos com o fator de correção de recuperação antes de ser transformados logaritmicamente. Quando o teste é feito usando uma curva de calibração obtida de amostras fortificadas antes do processo de extração, não há necessidade de correção por recuperação.

4.1.2. Supostos da análise de regressão linear

Para realizar uma análise de regressão linear é necessário que se cumpram os seguintes pressupostos básicos:

- Que existe homogeneidade de variâncias (homocedasticidade) entre os ln dos dados experimentais em cada ponto de amostragem (dia de abate).

- Que existe linearidade dos ln dos dados experimentais em função do tempo.

- Que existe distribuição normal (gaussiana) dos erros.

4.1.2.1. Homogeneidade de variâncias (homocedasticidade)

Deve-se confirmar que as variâncias dos ln dos dados experimentais dos diferentes dias de abate são homogêneas. Diferentes testes estatísticos podem ser usados para este propósito, como o teste de Bartlett1, o teste de Hartley9 e o teste de Cochran16.

4.1.2.2. Linearidade do ln dos dados experimentais

A inspeção visual do gráfico dos ln dos dados experimentais em função do tempo é, frequentemente, suficiente para assegurar que existe relação linear entre os dados experimentais. 

Um desvio da linearidade dos ln dos dados experimentais nos primeiros tempos de amostragem pode indicar que o processo de distribuição dos resíduos marcadores ainda não foi concluído e, portanto, estes pontos deveriam ser excluídos da análise. 

Desvios da linearidade nos últimos pontos de amostragem podem ser por causa de concentrações abaixo do LOD, portanto, o processo cinético de depleção tecidual não deve ser considerado nestes tempos de amostragem e está justificada a exclusão destes valores da análise estatística. 

Deve-se levar em conta que os outros dados experimentais presentes nos restantes pontos de amostragem devem ser conservados, a menos que a sua exclusão esteja devidamente justificada.  

Para assegurar estatisticamente a linearidade da reta de regressão, é preciso realizar uma análise de variância. O procedimento consiste em comparar a variação entre os grupos de médias e a reta estimada com a variação entre animais dentro dos grupos. 

4.1.2.3. Normalidade dos erros

A distribuição normal dos erros pode ser observada mediante inspeção visual das residuais ordenadas versus sua frequência de distribuição acumulativa em uma escala de probabilidade normalizada. 

As residuais são as diferenças entre os valores observados e seus correspondentes valores estimados (diferença entre os valores transformados logaritmicamente e os valores estimados pela reta de regressão).

Uma linha reta indica que a distribuição das residuais observada é consistente com o pressuposto de uma distribuição normal.  Para verificar os resultados do gráfico de residuais, pode ser aplicado o teste de Shapiro-Wilk13. Este teste tem demonstrado eficácia mesmo em presença de amostras pequenas. 

O gráfico da frequência acumulativa de distribuição das residuais pode ser usado com um teste muito sensível. Os desvios a partir da linha reta indicam uma distribuição não normal das residuais, que pode ser por causa de:

- Desvios a partir da normalidade dos dados das concentrações teciduais dos resíduos marcadores transformados logaritmicamente dentro de um ou mais grupos de abate.

- Desvios a partir dos valores estimados pela regressão linear (reta de regressão).

- Não homogeneidade de variâncias (heterocedasticidade).

- Valores aberrantes.

Na apresentação dos dados experimentais usando as residuais normalizadas (residual dividida pelo erro residual Sy, x), um valor aberrante poderia apresentar um valor <-4 o > + 4, indicando que a residual apresenta um valor desviado quatro desvios padrão da linha de regressão. O uso deste tipo de dados deve ser devidamente justificado. As informações do animal que se originou a amostra devem ter em conta.

4.1.3. Procedimento estatístico baseado no LMR

O período de carência deverá ser calculado usando os resultados dos dados estimados pela linha de regressão. O período de carência é o tempo em que o limite superior do intervalo de tolerância a 95% estimado com um intervalo de confiança a 95% intercepta o valor do limite máximo de resíduos (LMR).

Se este tempo não corresponde a um dia completo, o período de carência estimado se arredonda até o dia seguinte. Por exemplo, se o período de carência estimado é 6,3 dias, então, este será fixado em 7 dias. 

O valor do limite superior do intervalo de tolerância a 95% com um intervalo de confiança a 95% será calculado utilizando o método de distribuição de t não centralizado que se descreve no anexo. 

Não é válido estimar o período de carência a partir da ausência de dados de concentração tecidual menores que o LMR. Portanto, para calcular o mesmo, é necessário contar com dados experimentais que apresentem valores menores que LMR, pelo menos, no último tempo de amostragem. Preferentemente, o LOQ da técnica analítica deve ser pelo menos a metade do LMR utilizado. 

O período de carência pode ser estimado usando o software WT1.4 recomendado pela EMA.. O período de carência também pode ser estimado usando o método desenvolvido por Stange14 e proposto pela EMA5, que é metodologicamente mais simples de realizar e fornece resultados comparáveis com o método que utiliza a distribuição de t não centralizado. 

4.1.4 Procedimento alternativo baseado no LMR

Este procedimento, também conhecido como “regra de decisão”, é um método alternativo quando os dados experimentais disponíveis não permitem o uso do modelo estatístico baseado no LMR.

Não é possível propor recomendações gerais para este procedimento, já que os resultados dependerão do tamanho da amostra, do momento em que se realize o abate dos animais, da coleta das amostras biológicas, da variabilidade dos dados experimentais e dos fatores relacionados com a metodologia analítica. 

O método se baseia em estabelecer o período de carência no momento em que as concentrações teciduais de todos os animais se encontrarem abaixo do valor do LMR7. No entanto, uma vez que foi calculado o tempo, deve ser estabelecida uma margem de segurança para compensar a incerteza biológica que representa a variabilidade da cinética de depleção tecidual. 

A dimensão da margem de segurança dependerá de vários fatores relacionados com o desenho experimental e com as propriedades farmacocinéticas do princípio ativo estudado.

Apesar de não ser possível oferecer uma recomendação geral aplicável a todos os casos, um guia aproximado para calcular a duração da margem de segurança é aumentar em 10% - 30% o valor do tempo em que todas as concentrações teciduais se encontram abaixo do LMR. A outra alternativa é aumentar o mencionado tempo em um valor equivalente a 1-3 vezes a meia-vida de depleção tecidual. 

4.2. Tempo de carência estimado a partir dos resíduos no local de injeção

Além do efeito da formulação, da dose e da frequência de administração, a via de administração também exerce uma influência substancial sobre a duração do período de carência. As formulações injetáveis podem apresentar uma cinética de eliminação de resíduos a partir do local de injeção significativamente mais lenta que a observada nos demais tecidos comestíveis.  

Este fenômeno pode ser atribuído ao desenho de sistemas de liberação lenta, formulações de depósito, propriedades físico-químicas da molécula, a via de administração subcutânea, intramuscular ou outros fatores atribuíveis à variabilidade da via de administração (por exemplo, no tecido conectivo entre os músculos semitendinoso e semimembranoso).

Diferentemente de outros tecidos, a localização exata das amostras dos locais de injeção destinadas  a serem analisadas pode ter um impacto considerável sobre a concentração de resíduos encontrada. Além disso, o metabolismo e/ou degradação dos princípios ativos no local de injeção pode ocasionar que a composição do resíduo total seja muito diferente a respeito do encontrado em outros tecidos. 

Tudo isso demonstra que de um ponto de vista farmacológico, o local de injeção não é comparável de forma direta com músculo ou outros tecidos comestíveis. Da mesma forma, os períodos de carência estabelecidos para tecido muscular de localização remota a respeito do local de injeção não são adequados para assegurar que os resíduos presentes no local de injeção tenham reduzido a concentração em níveis abaixo do LMR e a ingestão diária admissível (IDA). Note-se que o procedimento para o cálculo da LMR inclui uma análise de risco de resíduos de medicamentos veterinários em alimentos baseados a IDA, que considerou a exposição alimentar aos resíduos ao longo da vida. 

Portanto, os resíduos no local de injeção precisam de uma consideração particular a respeito do risco para os consumidores dos animais tratados. 

4.2.1. Interpretação

Deve-se levar em conta que o período de carência no local de injeção estimado conforme este guia, não necessariamente deve ser considerado como o período de carência definitivo para o produto veterinário estudado.

O período de carência no local de injeção deve ser considerado em comparação com os períodos de carência baseados na depleção de resíduos nos outros tecidos comestíveis. Finalmente, o período de carência selecionado para o medicamento veterinário estudado deverá estar devidamente justificado.  

4.2.2. Princípios gerais

É necessário identificar os resíduos do local de injeção que são de interesse. No caso de medicamentos veterinários que contenham novos ingredientes ativos, os resíduos relacionados às moléculas ativas devem ser adequadamente identificados, incluindo metabolitos e produtos de degradação e/ou conversão, com potencial impacto biológico. Esta informação é obtida a partir de estudos de depleção de resíduos radiométricos (por exemplo: resíduo total) ou, quando apropriado, de estudos de depleção de resíduos dirigida a caracterização de resíduos toxicológica, farmacológica e microbiológica.

Para os medicamentos veterinários que contenham ingredientes ativos conhecidos, cuja composição de resíduos no local de injeção é conhecida, estudos de depleção de resíduos radiométricos não são necessários. O que é necessário é uma avaliação do ingrediente ativo original ou de qualquer outro componente relevante do resíduo no local de injeção (por exemplo: resíduo marcador). Informações relativas à relação entre o resíduo marcador / resíduos totais podem ser obtidos a partir de informações disponíveis na literatura. 

4.2.3 Desenho do estudo e coleta de amostras

Para a coleta da amostra, recomenda-se consultar o Guia n° 1 GF: “Guia Técnico para a Condução de Estudos de Metabolismo e Cinética de Resíduos de Agentes Farmacológicos de Uso Veterinário em Animais Produtores de Alimentos”, item 4.6.2.

O relatório do estudo de depleção de resíduos no local de injeção deverá ser acompanhado de uma descrição completa e detalhada do desenho e as condições experimentais, a seleção do local de injeção do produto, a técnica usada para a injeção, o instrumental utilizado, a profundidade da injeção (intramuscular), medidas tomadas para permitir a localização precisa do local de injeção no momento do abate, detalhe da técnica de obtenção e acondicionamento da amostra.

4.2.4 Procedimento

Deve ser levado em conta que a ingestão de resíduos do local de injeção, como mencionado acima, é um evento esporádico. Portanto, a determinação do período de carência deve basear-se em parâmetros que permitem a quantificação do risco de exposição alimentar a curto prazo. Dependendo das características do ingrediente ativo, as doses agudas de referência (ARfD) é o conceito mais adequado. No entanto, em alguns casos, pode ser recomendado o uso de um parâmetro de referência diferente. Além disso, a dose aguda de referência não está disponível para muitos ingredientes ativos. Nestes casos outro limite de referência deve ser proposto e justificado, incluindo: dose humana terapêutica, máxima ingestão recomendada (por exemplo: vitaminas), ingestão máxima tolerável (ej: minerais/oligoelementos), níveis basais ou naturais para compostos que podem ser produzidos endogenamente (por exemplo: hormônios). Um fator de segurança deve ser considerado para qualquer limite de referência selecionada.

Também é possível transformar o LMR do músculo ou gordura (de acordo com a espécie animal ou o ingrediente ativo em questão), aplicando um fator de 10 ou mais dentro de um limite de referência adequado. A seleção de qualquer limite de referência deve ser justificada.

Quando este procedimento é usado, é necessário verificar se o resíduo marcador é válido para predizer os resíduos de local de injeção.

Intervalos de segurança devem garantir que a concentração de resíduos caiu abaixo do limite de referência escolhido para o local de injeção dentro do período especificado. Ele pode ser calculado conforme descrito nos itens 4.1.3 e 4.1.4 para tecidos comestíveis.

ESQUEMA COMPARATIVO DE AMOSTRAGEM E ANÁLISE DOS TECIDOS COMESTÍVEIS E ESTIMATIVA DO PERÍODO DE CARÊNCIA MEDIANTE O PROCEDIMENTO BASEADO NO LMR.

1- O período de carência deve ser estimado para todos os tecidos comestíveis e será calculado baseado nos procedimenos propostos neste guia. O período de carência mais prolongado será considerado o mais apropriado.

2- Se o produto veterinário foi administrado por via parenteral (IM – SC), o período de carência do tecido muscular será substituido pelo período de carência dos tecidos no local de injeção. 

5. Referências

1- Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests. Proceedings of the Royal Statistical Society Series A 160, 268–282.

2- CVMP (1994) Position Paper: Approach towards Harmonisation of Withdrawal Periods, III/5934/94-EN, Nov. 1994.

3- David, H.A. (1952). "Upper 5 and 1% points of maximum F-ratio." Biometrika, 39, 422–424.

4- EMEA/CVMP/036/95: Note for Guidance: Approach Towards Harmonisation of Withdrawal Periods. (CVMP adopted April 96).

5- EMEA/CVMP/542/03-FINAL: Guideline on Injection Site Residues. (CVMP into effect April 2005).

6- FDA (1983), General Principles for Evaluating the Safety of Compound Used in Food-Producing Animals.

7- FDA (1994), General Principles for Evaluating the Safety of Compound Used in Food-Producing Animals.

8- Graf, U.; Henning, H.I.; Stange, P.T. (1987) Wilrich, Formeln und Tabellen der angewndten matematischen Statistik, 3rd ed., Springer Verlag, Berlin, Hidelberg, New York, London, Paris, Tokio.

9- Hartley, H.O. (1950). The Use of Range in Analysis of Variance Biometrika, 37, 271–280.

10- O'Brien, R.G. (1981). A simple test for variance effects in experimental designs. Psychological  Bulletin, 89, 570–574.

11- Owen, D.B. (1962), Handbook of Statistical Tables, Addison-Wesley Publishing Company, Reading, Massachusetts.

12- Pearson, E.S., Hartley, H.O. (1970). Biometrika Tables for Statisticians, Vol 1.

13- Shapiro, S. S.; Wilk, M. B. (1965). "An analysis of variance test for normality (complete samples)". Biometrika 52 (3-4): 591–611.

14- Stange, K. (1971) Angewandte Statistik, Vol. II, pp. 141-143, Springe Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

15- VICH (2009) Guidelines for the validation of analytical Methods used in residue Depletion Studies. VICH International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products, GL 49 (MRK) - Method Used in Residue Depletion Studies. For consultation at step 4 - Draft 1.

16- William, J., Conover (1999). Practical Nonparametric Statistics (Third Edition ed.) Wiley, New York, NY USA. pp. 388–395.

6. Anexo

Procedimentos estatísticos

Teste de Bartlett

O teste de Bartlett1 é usado para checar se um número de k amostras provém de populações que apresentam variâncias semelhantes. A igualdade de variâncias entre diferentes amostras se denomina homogeneidade de variâncias ou homocedasticidade. 

O uso do teste de Bartlett se justifica no fato de que muitos testes estatísticos como, por exemplo, o teste de diferenças de médias de t-de Student ou a análise de variância, admitem que as variâncias entre diferentes amostras são iguais.

A FDA6, 7 recomenda o uso deste teste devido a sua robustez, embora seja extremamente sensível a desvios de normalidade. Por outro lado, este teste só pode ser usado quando cada grupo de dados é igual ou maior a 5 (cinco). Apresente a vantagem de que é possível comparar grupos de dados de diferentes tamanhos. 

O teste de Bastlett é utilizado para verificar a hipótese nula H0 de que as variâncias populacionais são iguais a respeito da hipótese alternativa H1 de que ao menos dois são diferentes. Se dispusermos de k amostras com um tamanho de ni amostras e uma variância Si2 a estatística de Bartlett será: 

onde        y                                         é o estimador da variância total. 

O estatístico do teste de Bartlett tem aproximadamente uma distribuição ?2k-1. A hipótese nula é rejeitada quando ?2  > ?2k-1,? , onde ?2k-1,? é o valor crítico superior para uma distribuição ?2k-1.

Teste de Hartley 

Este teste, desenvolvido em 1950 por Hartley9, é também conhecido como teste de Fmax ou teste de Fmax de Hartley. É utilizado em análise de variância para verificar que diferentes grupos têm variâncias semelhantes, condição indispensável para realizar comparações entre grupos mediante a aplicação de testes estatísticos paramétricos. O teste apresenta a desvantagem de que só pode ser utilizado para comparar grupos de dados de igual tamanho. 

O teste se baseia no cálculo da relação entre a variância grupal maior (max sj2) e a variância grupal menor (min sj2). O valor resultante é então comparado com o valor crítico presente em uma tabela de distribuição de Fmax 3, 12. 

Admite-se que os grupos apresentam variâncias semelhantes se o valor calculado for menor que o valor crítico. 

O teste de Hartley admite que os dados de cada grupo apresentam distribuição normal e que os grupos apresentam igual número de indivíduos. Este teste, embora conveniente, é pouco sensível a desvios de distribuição normal10.

Teste de Cochran

Este teste, desenvolvido por William Gemmell Cochran16 é uma análise de duas vias de blocos aleatórios em que o resultado da comparação só pode ter dois resultados. O teste de Cochran, também conhecido como Teste Q de Cochran, é um teste de estatística não paramétrica. 

A EMEA5 considera que este é o melhor teste, já que é mais simples que o teste de Bartlett. Por outro lado, é menos sensível a desvios de normalidade que este último e, também, pode ser utilizado para analisar grupos de dados de diferentes tamanhos. 

O teste admite que o número de tratamentos experimentais é maior que dois (k>2) e que as observações estão organizadas em um determinado número (b) blocos, como se apresenta a seguir:

Tratamento 1

(k1) Tratamento 2

(k2) …. Tratamentoi

(ki)

Bloco 1 (b1) X11 X12 …. X1k

Bloco 2 (b2) X21 X22 …. X2k

Bloco 3 (b3) X31 X32 …. X3k

Bloco 4 (b4) …. …. …. …..

Blocoi  (bi) Xb1 Xb2 ….. Xbk

O teste de Cochran parte da hipótese nula (H0) que afirma que os tratamentos são iguais, e a hipótese alternativa (H1) afirma que existe diferença entre os tratamentos.

A estatística do teste de Cochran é:

onde

k é o número de tratamentos

X.j é o valor total das colunas ao jésimo tratamento

b é o número de blocos

Xi. é o valor total das células ao jésimo bloco

N é o valor do total das amostras

O nível de significância da região crítica está dado por:

onde X1-?, k-12  é o quantil (1-?) da distribuição de qui-quadrado com um grau de liberdade de k-1. A hipótese nula é rejeitada se o valor da estatística cai dentro da região crítica.

Teste de Shapiro-Wilk

Este teste foi publicado em 1965 por Samuel Shapiro e Martin Wilk13, e é utilizado para verificar a hipótese nula (H0) de que uma amostra X1,……,Xn provém de uma população com distribuição normal.

O teste parte da hipótese nula (H0) que afirma que os dados experimentais provêm de uma população com distribuição normal, e a hipótese alternativa (H1) afirma que os dados experimentais provêm de uma população com distribuição não normal. A estatística do teste é a seguinte:

                   

onde:

x(i) é a iésima ordem estatística, ex: o menor valor na amostra.

      é a média da amostra.

As constantes ai estão dadas pela seguinte equação:

onde

m1,….,mn são valores esperados da ordem estatística de variáveis independentes e com idêntica distribuição aleatória, provenientes de populações com distribuição normal e V é a matriz de covariância dessas ordens estatísticas.

A hipótese nula é rejeitada quando o valor da estatística (W) é menor que o erro alfa selecionado (0,05). Caso a estatística (W) seja maior que o nível alfa selecionado, então, não se pode rejeitar a hipótese nula e se admite que os dados experimentais provêm de uma população com distribuição normal.  

Cálculo do limite superior do intervalo de tolerância

Embora a FDA6, 7 proponha estimar o limite superior do intervalo de tolerância a 99% com um  intervalo de confiança a 95%, existe uma objeção a esse critério que é a excessiva extrapolação dos valores do intervalo de tolerância já que, muitas vezes, este intercepta o valor do LMR em um tempo posterior aos valores das últimas concentrações teciduais detectadas. Esta excessiva extrapolação pode resultar em uma inadequada estimativa do tempo de carência. A EMEA5 propõe um intervalo de tolerância a 95%, minimizando o problema da extrapolação e proporcionando uma estimativa mais realista do tempo de carência. 

Método de distribuição de t não centralizado (FDA)

O limite superior do intervalo de tolerância a qualquer tempo se calcula segundo a seguinte equação:

onde:

k = 95mo percentil de uma distribuição de “t” não centralizado com um parâmetro não centralizado “d” e graus de liberdade igual a S2.

z = 95mo percentil de uma distribuição padrão normalizada.

Para calcular o valor de “k”, consultar D.B. Owen, Handbook of Statistical Tables, Addison-Wesley, Reading, Massachusetts (1962)11. Utilizando o valor de “d” e a tabela de fatores para o cálculo dos valores críticos da distribuição de “t” não centralizado com um percentil de 95% (0,95) e “n” graus de liberdade.

O limite superior do intervalo de tolerância se calcula como o antilogaritmo do valor calculado. Conferir que o valor estimado não exceda o valor do LMR. Se isso acontecer, deve-se aumentar o valor de t e repetir o procedimento de cálculo até que o valor calculado seja inferior ao LMR. Nesse caso, o valor de t se corresponde com o tempo de carência. 

Método de Stange (EMEA)

O cálculo do limite superior do intervalo de tolerância a 95% com um intervalo de confiança a 95% pode ser realizado também com o procedimento reportado por de Stange14, como se descreve a seguir:

Ty = a + bt +kT sy.x

onde: 

Ty = limite superior do intervalo de tolerância a um tempo de amostragem determinado

a = ponto onde a reta cruza o eixo da ordenada

b = pendente da reta

t  = tempo.

Os respectivos valores estatísticos da distribuição normal padronizada são:

- Para 1-? = u1-? = 1.6449

- Para 1-? = u1-? = 1.6449

Sy, x = erro residual,  ()* = (2n-5) segundo Graf et al.7.

A correção proposta por Graaf8, utilizando o termo (2n-5) no lugar de (2n-4), resulta em um limite do intervalo de tolerância levemente maior. Segundo Stange, a equação é válida para um valor de n ? 10, enquanto Graf aumenta a validez do cálculo a um valor de n ? 20.

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Data de vigência

Maio de 2011

Frequência de revisão

5 anos